质粒表达验证，提取质粒如何验证-技术开发-韩韩H5开发

1CRISPR设计和特异性

即使在接近基因组的不同CRISPR之间，CRISPR核酸内切酶活性也存在很大差异。1因此，建议针对不同的DNA序列测试三到四种CRISPR核酸酶。由于CRISPR系统中DNA靶位点的大小远小于CompoZrZFN所需的大小，因此在设计过程中必须小心，以最大程度地减少基因组中其他位置的脱靶效应。最近的证据表明，脱靶CRISPR核酸内切酶是一个令人担忧的题，一些组织正在制定指南来防止脱靶活性5,8。此外，虽然有许多用于CRISPR设计的在线工具可用，但我们已将特定ZFN设计的核心功能应用于CRISPR/Cas系统，以在计算机上生成CRISPR靶序列的全基因组***。查看我们的在线CRISPR产品列表，了解最新的CRISPR设计套件以及ZFN、CRISPR和相关供体DNA的定制设计服务。欲了解更多信息，请访默克西格玛试剂网站（wwwsigmaaldrichcn）。

2用于细胞培养应用的CRISPR质粒递送

注意除非通过定制要求指定，否则我们的CRISPR质粒产品以小份制备形式提供，可能不适合转染某些细胞类型。为了获得结果，建议在转染前使用无内素DNA纯化试剂盒大规模制备质粒。之前的ZFN项目经验表明，核转染对于多种细胞类型来说是一种可靠的递送方法。对于人类细胞的初步实验，我们建议将大规模制备的CRISPR质粒DNA核转染到经过充分验证的细胞类型（例如K562或U2OS）中，以评估双链断裂活性或供体整合的水平。这些细胞系已被证明具有高水平的同源重组反应性2，使其成为测试新设计的供体构建体与ZFN和CRISPR核酸酶的兼容性的理想选择，然后再转向更具挑战性或未知的细胞类型。对于小鼠和大鼠细胞培养测试，Neuro2A和C6是适合初始CRISPR实验的细胞类型。剂量实验的一个良好起点是每0.5至100万个细胞2至8gCRISPR质粒。我们的单一载体包含GFP连接的Cas9表达盒，允许在进行基因分型或单细胞克隆实验之前通过显微镜或FACS检查转染细胞以监测转染效率。

图1.通过显微镜或FACS监测Cas9-GFP表达盒活性。

3监测CRISPR双链断裂活性

目前有几种已发布的用于监测双链断裂DSB活动的方案。最快速、灵活且经济的测定法是错配切除测定法，它检测真核细胞中NHEJ活性产生的插入和缺失的多样性。最常用的方案使用CEL-I酶6和T7核酸内切酶I。7如果您的机构拥有足够的生物信息学和深度测序资源，深度测序也可用于检测和量化CRISPR处理的细胞群中的插入和缺失活性。如果您在尝试了许多常见的CRISPR设计后仍无法检测DSB活性，请考虑丰富细胞群的Cas9-GFP表达，如下一节所述。

4单细胞克隆和基因分型

该产品中的质粒包含GFP连接的Cas9表达盒，允许使用荧光激活细胞分选FACS来分离Cas9诱导修饰频率显着增加的细胞群。这种FACS富集方法在递送效率和/或Cas9表达水平低或不可检测的情况下特别有用。此外，与其他报告载体相比，GFP共表达方法具有以下优点Cas9-GFP连接的表达不需要将人工靶位点克隆到替代报告质粒中的额外步骤。b)转染的dsDNA总量减少。在许多情况下，某些细胞类型对高剂量的dsDNA敏感，并且以替代报告质粒形式向现有CRISPR和供体载体构建体添加额外的dsDNA可能会导致细胞性。c)通过Cas9-GFPmRNA、体外转录的gRNA和单链寡核苷酸可实现“无dsDNA”方法。Cas9和GFP蛋白编码区通过编码2A肽的小序列连接。2A肽是一种“自裂解”肽，它允许从一个转录物产生两种独立的蛋白质，并利用“核糖体跳跃”而不是蛋白水解裂解机制。可以按照一般方案收集3,14细胞用于FACS。建议将细胞分为低、中、高GFP表达水平的部分。具有最高GFP表达的细胞群被证明可以进行基因组编辑富集，“高”细胞群占总细胞群的1到30个。“高”和“中”群体的大小可能因基因组区域、细胞类型、递送方法和其他实验变量而异。建议将细胞群分为三部分低、中、高。每个片段占细胞总数的1到20。

图2通过FACS检测，靶向人KRAS基因座的单个Cas9-GFP载体增强了人K562细胞中CRISPR/Cas诱导的CEL-I活性。

5质粒图谱和特征

该载体中的Cas9蛋白含有HNH和RuvC活性，可产生双链断裂。Cas9与Evrogen的TagGFP2荧光蛋白相连。TagGFP2是TagGFP的改进变体，TagGFP是大型水母GFP样蛋白的突变体。15,17TagGFP2表现出亮绿色荧光，激发/发射最大值分别为483和506nm。2A-GFP编码序列的两侧是两个HpaI性位点，允许去除或替换2A-GFP元件。XbaI位点可用于通过使用T7RNA聚合酶进行体外转录来线性化用于Cas9-GFPmRNA生产的载体。