重大动物疫情分为颜色，我国将突发重大动物疫情分为几级

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2013年和2014年，一种新的重组H7N9甲型流感病跨越了家禽物种屏障，引起了人类感染。快速检测H7N9新型病对于在家禽中检测病、降低禽类或人类流行病风险具有重要意义。

H7N9病

1996年至2014年，世界多个地区报告了H7亚型的人类感染。这些感染大多数与家禽的疫情有关。感染主要引起结膜炎和轻微的上呼吸道症状。截至2013年3月，尚无人类感染H7N9病的报告。

这种情况引起了紧迫的题和全公共卫生担忧，因为这种新的重组H7N9病以前从未在动物或人类中发现过，截至2014年7月14日，已确认451例人类感染病例。感染者曾接触过活禽或可能受污染的环境，尤其是销售活禽的市场。

监测家禽更加困难，因为H7N9流感不会杀死家禽。因此，快速识别不同类型家禽样本中的H7N9病以控制传播给人类的可能性非常重要。H7N9病检测现在通常在实验室进行。它包括从孵化蛋中分离病，然后通过血凝和血凝抑制等血清学方法鉴定HA和NA亚型。

然而，如果这种新的H7N9病要成为人类严重疾病和死亡的原因，则需要在比典型流感病具有更高生物安全标准的实验室中进行检测，并且从胚胎中分离H7N9病可能会增加感染风险。实验室工作人员。需要快速、灵敏的分子方法来识别H7N9病，以促进临床治疗和感染控制。

rRT-PCR等分子检测方法因其灵敏度高、检测时间快而广泛应用于病感染的实验室诊断，自H7N9病出现以来，rRT-PCR方法已被开发用于H7N9病检测。世界卫生组织流感中心参考研究合作中心开发了检测H7N9病的rRT-PCR方案，但该方法无法同时检测病的HA和NA基因。

在这里，我们描述了一种多重rRT-PCR检测方法，可同时检测H7N9病和其他甲型流感病，具有高特异性和灵敏度，并且该检测方法可以在不到25小时（加上RNA提取所需的时间）内获得。H7N9和其他甲型流感病的实验室监测和快速诊断。

多重rRT-PCR检测方法

H7N9病的核苷酸序列是从我们实验室的病序列中获得的，根据52个序列的保守区选择H7和N9引物和探针，并使用Lasergene和PrimerExpress设计和分析引物和探针。30、选择M基因用于甲型流感病的检测，M基因的引物和探针组取自WHO推荐。

本研究中使用的引物和探针使用在339末端标记有BHQ3的两个探针，在539末端标记有三种不同的荧光报告染料，从而允许在单个反应中同时检测三个基因。

根据制造商的说明，使用QIAmpViralRNAMiniKit从样品中提取病RNA，并使用AgPath-ID一步RT-PCR试剂盒在含有10L2的20L反应混合物中执行多重rRT-PCR。RT.-PCR缓冲液、08L25RT-PCR酶混合物、4LRNA样品RNA和3组引物和探针。

H7、N9和M基因引物的优化浓度为06M、06M和07M，而H7、N9和M基因探针的最终浓度为04M、04M和06M，分别。使用LightCycler480实时PCR系统进行反应。rRT-PCR程序包括40个逆转录步骤、45C30分钟、95C10分钟、95C5秒和60个扩增循环。在1分钟C延伸步骤中评估荧光信号。

使用源自H1-H16和N1-N9流感病株以及其他禽呼吸道病病原体的RNA样本评估多重rRT-PCR测定的特异性，正如预期的那样，所有含有H7亚型病的样本均显示出阳性FAM荧光信号.指出。正如预期的那样，含有N9亚型病的样本均显示出阳性JOE荧光信号。此外，所有甲型流感参考株均在Cy5通道中产生标准荧光信号。

甲型流感参考菌株

rRT-PCR检测H7基因的具体结果是，只有两种H7亚型病在FAM通道中产生阳性曲线。

用于检测N9基因的rRT-PCR检测的具体结果仅包括在JOE通道中产生阳性曲线的两种N9亚型病。

甲型流感rRT-PCR检测的具体结果表明，只有甲型流感参考株在Cy5通道中产生阳性曲线。

使用A/pigeon/Shanghai/S1069/2013RNA的连续10倍稀释（范围从10到10-8）评估该测定的检测限，每个反应检测到多达56个H7、N9和M拷贝。基因的荧光信号。

为了评估测定的再现性，测试了10、10-2和10-4稀释度的六次重复，并计算变异系数以测量测定的内部和内部再现性。单次运行范围为011至122，而不同运行的变异系数范围为078至148，表现出良好的重现性。

为了进一步评估该检测方法，对1,070份气管和泄殖腔拭子进行了检测，其中24份甲型流感病阳性样本经病分离鉴定，其中7份为H7N9病，并对23份样本进行多重rRT-PCR，鉴定出甲型流感病。这是H7N9病。

培养阳性但rRT-PCR阴性的样本与甲型流感病序列一致，RT-PCR确认19份样本含有甲型流感病，其中4份为H7N9。这些结果表明多重rRT-PCR和病分离效果非常好。这表明多重rRT-PCR检测比RT-PCR方法更灵敏、更准确。

导致人类严重呼吸道感染的新型H7N9病首先在中国发现，虽然此前已有H7亚型病传播给人类的报道，但这是N9亚型病首次感染人类。可见，H7N9新病均源自家禽，含有H7、N9、H9N2甲型流感病的重组基因。病突变可以促进这种传播。

甲型流感病重组的潜在风险

由于新型H7N9病可以在无症状的情况下传播给家禽，因此对该病在家禽中的监测和检测受到了广泛关注。在本研究中，我们开发了一种一步式多重rRT-PCR检测方法，可以同时识别H7N9和其他流感病。病。开发了它。病检测的一步性质降低了残留污染的风险。

重复实验表明，与单探针rRT-PCR相比，多重检测并没有改变检测限的灵敏度，使用标记有不同荧光染料的特定探针来区分H7N9和其他甲型流感病。病显示出三重荧光信号。

此外，该检测还可以检测其他菌株的H7或N9亚型。如果仅检测到H7而未检测到N9，则表明样本中存在H7病的其他NA亚型。同样，如果您没有检测到H7，而只有H7到N9。这意味着样本中存在N9病的另一种HA亚型。对于所有三个目标基因，该测定的检测限为每次反应56个拷贝。

对1070份家禽样本进行检测后，发现23份rRT-PCR检测结果呈阳性；这些阳性样本的Ct值在25至28范围内，而大多数阴性样本的Ct值>30且在rRT-PCR中。范围.指示.基于家禽样本中的Ct值，PCR检测的准确度>95，并且由于rRT-PCR检测是为了检测家禽的临床样本而开发的，因此建议Ct30被视为阳性。

如果Ct在30~32之间且扩增曲线清晰，则进行复测，如果重复结果与之前相同，则判定为阳性；如果初始Ct在30~32之间，则进行复测。如果您的测试结果高于32，则您的样本将需要使用其他方法进行测试，例如测序。

总之，在本研究中，我们开发并评估了一种灵敏且特异的多重rRT-PCR检测方法，用于检测H7N9和其他甲型流感病，与RT-PCR和病分离相比，rRT-PCR检测速度更快，并且在25小时，你就会得到结果。这对于H7N9病的快速检测具有重要意义，我们希望这种准确、快速的诊断方法能够为H7N9及其他甲型流感病的预防和检测做出贡献。

结论

在本研究中，我们开发了一种多重实时RT-PCRrRT-PCR检测方法，用于快速检测H7N9和其他甲型流感病，以评估多种甲型流感病、其他禽呼吸道病和1,070个家禽样本的检测方法。

参考

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什么是人畜共患病预防？是指动物疫病的预防、控制和消灭以及动物和动物产品的检疫。动物传染病的预防，综合运用多种手段，动员全社会力量，按照动物传染病发生、发生、消亡的科学规律，从引进、饲养、管理、销售、运输、屠宰等各个环节对动物进行控制。我们所做的。动物产品加工、经营、储存、运输等环节严格落实生产、销售等各环节防控、扑灭、检疫措施，保障动物健康和产品安全，是一项系统性工作。

什么是第一类传染病、第二类传染病、第三类传染病？常见动物疫病口蹄疫、猪大疱病、猪瘟、非洲猪瘟、高致病性蓝耳病、非洲马热、牛瘟、牛传染性胸膜肺炎、牛海绵状脑病、痒病、蓝舌病、反刍动物鼠疫、羊痘和山羊痘、高致病性禽流感、新城疫、鲤鱼病血症、白斑综合症

常见第二类动物疫病狂犬病、布病、炭疽病、伪狂犬病、梭菌病、副结核病、弓形体病、包虫病、钩端螺旋体病。

三种常见的动物疾病大肠杆菌病、李斯特菌病、甲癣、放线菌病、肝片吸虫病、盘尾丝虫病、红细胞增多症和Q热。

动物疫病动物疫病是指动物的传染病、寄生虫病。一类传染病对人畜造成严重危害，需要采取紧急、严格强制预防、控制和消灭措施的一类传染病。二类疫情二类疫情会造成严重的经济损失，需要采取严格的控制、消灭等措施，防止其蔓延。第三类传染病属于常见病、多发病，可造成重大经济损失，需要控制和净化。政策国家对动物疫病实行预防为主的政策。参考文献全国人民代表大会常务委员会，《中华人民共和国动物疫病防治法》北京全国人民代表大会常务委员会，1997年7月3日

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